Rapporto molare inserto:vettore

Un calcolatore del rapporto molare inserto:vettore in una ligazione indica quanti nanogrammi di DNA inserto Lei deve aggiungere a una massa nota di vettore linearizzato perché i due frammenti raggiungano il rapporto molare scelto. Poiché un frammento più lungo è più pesante per molecola, masse uguali non sono moli uguali: un plasmide di 3 kb supera in massa un inserto di 500 bp circa sei a uno, così una ligazione 1:1 mescolata con gli stessi nanogrammi lascerebbe la reazione senza inserto. La formula consueta scala la massa del vettore per il rapporto delle lunghezze inserto/vettore e poi per il rapporto molare obiettivo, di solito 3:1 per estremità coesive oppure tra 1:1 e 5:1 quando si esplorano le condizioni.

Perché nanogrammi uguali non sono una ligazione 1:1

Le ligazioni di clonaggio molecolare uniscono un vettore linearizzato e un inserto con T4 DNA ligase. La chimica dipende dall'incontro di estremità compatibili, dunque da quantità molari, non dalle masse in scala di milligrammi che uno spettrofotometro riporta. Il DNA a doppio filamento ha una massa pressoché costante per paio di basi, per convenzione 650 grammi per mole per paio di basi, così il numero di moli in un'aliquota di nanogrammi è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento.

Cinquanta nanogrammi di un plasmide di 3000 bp sono quindi sei volte più moli di cinquanta nanogrammi di un inserto di 500 bp. Se mescola quelle masse uguali ha costruito una reazione 1:6 inserto:vettore, l'opposto dell'eccesso di inserto 3:1 che raccomandano la maggior parte dei protocolli a estremità coesive. La correzione è una proporzione: la massa dell'inserto è la massa del vettore per (lunghezza dell'inserto divisa per quella del vettore) per il rapporto molare inserto:vettore obiettivo.

Per 50 ng di vettore di 3000 bp, un inserto di 500 bp e un rapporto 3:1, ciò è 50 × (500 / 3000) × 3 = 25 ng. Le ligazioni a estremità piatte partono spesso più vicine a 1:1 o 5:1 e usano ancora la stessa identità; cambia solo il rapporto. Questo calcolatore applica quell'identità e riferisce anche i picomoli impliciti con 650 g/mol per paio di basi così Lei può confrontare una lettura NanoDrop con una tabella di protocollo molare senza aprire un foglio di calcolo.

Dove un calcolatore del rapporto inserto:vettore in ligazione trova impiego

I laboratori didattici e i corsi di clonaggio usano un calcolatore del rapporto inserto:vettore perché gli apprendisti smettano di trattare i nanogrammi come intercambiabili e possano mostrare i 25 ng di inserto che spettano a 50 ng di un vettore di 3 kb a 3:1. Le piattaforme centrali e i quaderni di preparazione del plasmide tengono la stessa identità accanto alle letture dello spettrofotometro quando un prodotto PCR è più corto dello scheletro e una miscela 1:1 in massa lascerebbe la reazione con poco inserto.

I siti di contenuti che si posizionano su un calcolatore del rapporto inserto vettore in ligazione traggono beneficio da un controllo dal vivo il cui percorso gratuito nel browser coincide con quello di automazione prepagata sullo stesso modulo puro. La convalida fallita non consuma il saldo.

Le ricerche della temperatura di fusione di primer sovrapposti o del disegno di sovrapposizione Gibson sono intenzioni diverse: resti in questa pagina quando gli ingressi sono due dimensioni di frammento più una massa di vettore e l'uscita i nanogrammi di inserto per un rapporto molare obiettivo.