Calcolatore proteina Bradford

Il saggio proteico di Bradford resta uno dei metodi colorimetrici più comuni per quantificare la proteina totale in campioni purificati, lisati e intermedi di processo. Dopo il legame del colorante, uno spettrofotometro riporta l’assorbanza—tipicamente vicino a cinquecentonovantacinque nanometri—e il laboratorio converte quella lettura in concentrazione mediante una curva standard costruita da standard proteici noti come BSA. Questo calcolatore di concentrazione proteica Bradford accetta l’assorbanza del campione corretta con bianco insieme a pendenza e intercetta di una curva standard lineare adattata A uguale a m per C più b, moltiplica opzionalmente per un fattore di diluizione quando il pozzetto misurato è stato diluito, e restituisce la concentrazione dello stock con un contratto numerico arrotondato e stabile.

Come l’assorbanza Bradford diventa concentrazione proteica

Il blu brillante di Coomassie G-250 sposta il proprio spettro di assorbanza quando lega proteina in condizioni acide di saggio, così i pozzetti con più proteina appaiono più blu e leggono un’assorbanza più alta alla lunghezza d’onda del saggio. L’assorbanza assoluta da sola non è una concentrazione universale: lotto del colorante, temperatura, cammino ottico, composizione proteica e bianco dello strumento spostano la risposta.

I laboratori preparano quindi una serie di standard a concentrazioni note, misurano le assorbanze con lo stesso protocollo delle incognite e adattano un modello lineare della forma assorbanza uguale a pendenza per concentrazione più intercetta sull’intervallo di lavoro lineare. Note pendenza m e intercetta b, qualsiasi assorbanza di campione A si inverte nella concentrazione C uguale a (A meno b) diviso m.

Se il campione è stato diluito prima del saggio—ad esempio cinque volte affinché la lettura resti nella curva standard—la concentrazione dello stock non diluito è quel valore invertito moltiplicato per il fattore di diluizione. Questa capacità non adatta la curva standard per Lei, non media pozzetti replica e non applica modelli logistici a quattro parametri non lineari; applica l’inversione lineare di cui già si fida da foglio di calcolo o software del lettore di piastre. La pendenza zero viene rifiutata perché la divisione per zero non può recuperare la concentrazione.

Concentrazioni calcolate leggermente negative possono comparire quando un campione rumoroso resta sotto l’intercetta; l’aritmetica restituisce comunque il numero così che gli script di controllo qualità segnalino pozzetti fuori intervallo invece di nasconderli con un clamp silenzioso a zero.

Flussi di laboratorio, limiti e intenti di ricerca di questo strumento

Flusso tipico: esegua standard di BSA o di un’altra proteina, adatti la regione lineare per ottenere pendenza e intercetta, corregga con bianco l’assorbanza del campione, inserisca quei tre numeri, imposti la diluizione quando l’aliquota misurata è stata diluita e registri la concentrazione accanto all’identificatore del campione. Frazioni di purificazione proteica, controlli di carico uguale di lisati cellulari, preparazione di campioni ELISA e laboratori didattici necessitano della stessa inversione deterministica senza riaprire un foglio di calcolo.

Limiti: questo strumento non sostituisce la necessità di standard, non corregge la risposta non lineare del colorante ad alto carico proteico, non converte tra equivalenti BSA e massa reale dell’analita per ogni specie proteica, e non sceglie le unità—i risultati sono nelle unità di concentrazione usate dalla curva standard (comunemente microgrammi per millilitro o milligrammi per millilitro). Diluisca i campioni che leggono sopra lo standard più alto nell’intervallo lineare e passi il fattore di diluizione invece di estrapolare alla cieca.

L’intento di ricerca di questa pagina include calcolatore di concentrazione proteica Bradford, assorbanza del saggio Bradford a concentrazione, pendenza e intercetta di curva standard proteica online, e quantificazione proteica A595 da regressione lineare. La validazione fallita non consuma il saldo prepagato, così gli script esplorativi che provano pendenze vuote restano economici.