Calcolatore di efficienza qPCR

La PCR quantitativa (qPCR) riporta un ciclo di quantificazione (Cq o Ct) che, in un saggio esponenziale ben condotto, scala in modo lineare con il logaritmo in base dieci della quantità iniziale di stampo. La pendenza di quella curva standard non è un coefficiente decorativo: cifra l’efficienza di amplificazione per ciclo tramite l’identità in forma chiusa E uguale a dieci elevato a meno uno fratto la pendenza, meno uno. Questo calcolatore di efficienza qPCR applica quell’identità con esattezza. Indichi la pendenza adattata di Ct rispetto a log10(concentrazione) o log10(numero di copie) e l’operazione restituisce l’efficienza in percento, la frazione adimensionale E e il fattore di amplificazione per ciclo dieci elevato a meno uno fratto la pendenza. Una pendenza vicina a −3.32 corrisponde al cento per cento, il raddoppio perfetto a ogni ciclo.

Che cosa significa la pendenza della curva standard per l’efficienza qPCR

La reazione a catena della polimerasi quantitativa, detta anche PCR in tempo reale, misura la fluorescenza a ogni ciclo e riporta un ciclo di quantificazione Cq (storicamente Ct) al quale il segnale supera una soglia scelta. Quando una serie di diluizioni di uno stampo noto viene eseguita in condizioni identiche, il grafico di Cq rispetto al logaritmo in base dieci della concentrazione o del numero di copie iniziali è la curva standard.

Nel regime esponenziale quella retta è lineare e la sua pendenza stima in via sperimentale l’efficienza di amplificazione per ciclo. Moltiplicare E per cento esprime l’efficienza in percento, che è il modo in cui gli articoli di metodo, le checklist MIQE e i foglietti dei kit comunicano le prestazioni del saggio. Il raddoppio perfetto significa che ogni ciclo moltiplica il prodotto per due, così uno più E vale due, E vale uno e l’efficienza è cento per cento.

Risolvere dieci elevato a meno uno fratto la pendenza uguale a due dà pendenza uguale a meno log10 di due, circa −3.321928. Pendenze più dolci come −3.10 implicano efficienze sopra il cento per cento; pendenze più ripide come −3.58 implicano efficienze vicine al novanta per cento.

Questo calcolatore non adatta punti Cq, non stima R-squared e non inverte un Cq verso la quantità iniziale: converte una pendenza già adattata in E e in E percento con una valutazione deterministica in virgola mobile che Lei può fissare nei test e nel taccuino elettronico.

Contratto di ingresso, campi di risposta e convalida

L’esempio classico da manuale, pendenza −3.32, restituisce un percento molto vicino a cento, perché dieci elevato a uno fratto 3.32 sta appena sopra due. Una pendenza di −3.58 è l’esempio d’aula abituale vicino al novanta per cento. Una pendenza esattamente zero è rifiutata perché meno uno fratto la pendenza non è definito: il messaggio afferma che la pendenza della curva standard è zero.

Si rifiuta anche una pendenza così vicina a zero che la potenza trabocca verso un numero non finito. La convalida fallita non viene fatturata. Le pendenze qPCR tipiche sono negative; una pendenza positiva è definita in matematica e viene restituita invece di essere indovinata, ma è insolita per una serie di diluizione in cui Cq aumenta quando lo stampo diminuisce.

Flussi di saggio, finestre di accettazione e intento di ricerca

Chi sviluppa metodi usa dal novanta al centodieci per cento come finestra comune di accettazione per un nuovo saggio a sonda di idrolisi o SYBR; valori molto fuori da quella fascia segnalano dimeri di primer, bias di pipettaggio, inibizione o un adattamento non lineare.

I laboratori didattici possono fissare la pendenza ideale a meno log10 di due così gli studenti vedono cento per cento, poi spostarla a −3.6 o −3.1 per mostrare come un piccolo cambiamento di pendenza si traduca in un grande cambiamento di E, perché la mappa è esponenziale. Limiti: questo strumento non adatta i punti, non calcola R-squared né l’intercetta, non converte Cq in copie e non applica una variazione in volte di quantificazione relativa di Pfaffl. La convalida fallita non consuma il saldo prepagato.