Calculadora de eficiência qPCR

A PCR quantitativa (qPCR) informa um ciclo de quantificação (Cq ou Ct) que, em um ensaio exponencial bem-comportado, escala de forma linear com o logaritmo na base dez da quantidade inicial de molde. A inclinação dessa curva padrão não é um coeficiente decorativo: ela cifra a eficiência de amplificação por ciclo por meio da identidade de forma fechada E igual a dez elevado a menos um dividido pela inclinação, menos um. Esta calculadora de eficiência qPCR aplica essa identidade com exatidão. Informe a inclinação ajustada de Ct versus log10(concentração) ou log10(número de cópias) e a tarefa devolve a eficiência em por cento, a fração adimensional E e o fator de amplificação por ciclo dez elevado a menos um dividido pela inclinação. Uma inclinação próxima de −3.32 corresponde a cem por cento, a duplicação perfeita em cada ciclo.

O que a inclinação da curva padrão significa para a eficiência qPCR

A reação em cadeia da polimerase quantitativa, também chamada PCR em tempo real, mede a fluorescência a cada ciclo e informa um ciclo de quantificação Cq (historicamente Ct) no qual o sinal cruza um limiar escolhido. Quando uma série de diluições de molde conhecido é corrida em condições idênticas, o gráfico de Cq versus o logaritmo na base dez da concentração ou do número de cópias iniciais é a curva padrão. No regime exponencial essa reta é linear, e a inclinação estima experimentalmente a eficiência de amplificação por ciclo.

Multiplicar E por cem expressa a eficiência em por cento, que é como artigos de método, listas MIQE e bulas de kit comunicam o desempenho do ensaio. Duplicação perfeita significa que cada ciclo multiplica o produto por dois, de modo que um mais E vale dois, E vale um e a eficiência é cem por cento. Resolver dez elevado a menos um dividido pela inclinação igual a dois dá inclinação igual a menos log10 de dois, cerca de −3.321928.

Inclinações mais suaves, como −3.10, implicam eficiências acima de cem por cento; inclinações mais íngremes, como −3.58, implicam eficiências perto de noventa por cento. Esta calculadora não ajusta pontos Cq, não estima R-squared nem inverte um Cq para a quantidade inicial: ela converte uma inclinação já ajustada em E e em E por cento com uma avaliação determinística de ponto flutuante que você pode fixar em testes e no caderno eletrônico.

Contrato de entrada, campos de resposta e validação

O exemplo clássico de manual, inclinação −3.32, devolve um por cento bem próximo de cem, porque dez elevado a um dividido por 3.32 fica logo acima de dois. Uma inclinação de −3.58 é o exemplo de sala habitual perto de noventa por cento. Uma inclinação exatamente zero é recusada porque menos um dividido pela inclinação não está definido: a mensagem afirma que a inclinação da curva padrão é zero.

Também se recusa uma inclinação tão próxima de zero que a potência transborda para um número não finito. Validação falha não é faturada. Inclinações típicas de qPCR são negativas; uma inclinação positiva está definida matematicamente e é devolvida em vez de ser adivinhada, mas é incomum em uma série de diluição na qual Cq aumenta quando o molde diminui.

Fluxos de ensaio, janelas de aceitação e intenção de busca

Quem desenvolve métodos usa de noventa a cento e dez por cento como janela comum de aceitação para um ensaio novo de sonda de hidrólise ou SYBR; valores muito fora dessa faixa apontam dímeros de primer, viés de pipetagem, inibição ou um ajuste não linear.

Laboratórios de ensino podem fixar a inclinação ideal em menos log10 de dois para que os estudantes vejam cem por cento e depois movê-la para −3.6 ou −3.1 para mostrar como uma mudança pequena na inclinação se traduz em uma mudança grande de E, porque o mapa é exponencial. Limites: esta ferramenta não ajusta os pontos, não calcula R-squared nem a ordenada na origem, não converte Cq em cópias e não aplica uma mudança de vezes de quantificação relativa de Pfaffl. Validação falha não consome saldo pré-pago.