Calculadora proteína Bradford

O ensaio de proteína de Bradford continua sendo um dos métodos colorimétricos mais comuns para quantificar proteína total em amostras purificadas, lisados e intermediários de processo. Após a ligação do corante, um espectrofotômetro reporta a absorbância—tipicamente perto de quinhentos e noventa e cinco nanômetros—e o laboratório converte essa leitura em concentração com uma curva padrão construída a partir de padrões de proteína conhecidos como BSA. Esta calculadora de concentração de proteína Bradford aceita a absorbância da amostra corrigida com branco junto com a inclinação e o intercepto de uma curva padrão linear ajustada A igual a m vezes C mais b, multiplica opcionalmente por um fator de diluição quando o poço medido foi diluído, e devolve a concentração do estoque com um contrato numérico arredondado e estável.

Como a absorbância Bradford se torna concentração de proteína

O azul brilhante de Coomassie G-250 desloca seu espectro de absorbância ao se ligar à proteína em condições ácidas de ensaio, de modo que poços com mais proteína ficam mais azuis e leem uma absorbância maior no comprimento de onda do ensaio. A absorbância absoluta sozinha não é uma concentração universal: lote do corante, temperatura, comprimento de caminho, composição proteica e branco do instrumento movem a resposta.

Por isso os laboratórios preparam uma série de padrões em concentrações conhecidas, medem suas absorbâncias com o mesmo protocolo das incógnitas e ajustam um modelo linear da forma absorbância igual a inclinação vezes concentração mais intercepto na faixa de trabalho linear. Uma vez conhecidos a inclinação m e o intercepto b, qualquer absorbância de amostra A se inverte para a concentração C igual a (A menos b) dividida por m.

Se a amostra foi diluída antes do ensaio—por exemplo cinco vezes para que a leitura fique dentro da curva padrão—a concentração do estoque não diluído é esse valor invertido multiplicado pelo fator de diluição. Esta capacidade não ajusta a curva padrão por você, não média poços réplica e não aplica modelos logísticos de quatro parâmetros não lineares; aplica a inversão linear em que você já confia a partir de planilha ou software do leitor de placas. Inclinação zero é rejeitada porque divisão por zero não recupera concentração.

Concentrações calculadas ligeiramente negativas podem aparecer quando uma amostra ruidosa fica abaixo do intercepto; a aritmética ainda devolve o número para que scripts de controle de qualidade marquem poços fora da faixa em vez de escondê-los com um corte silencioso em zero.

Fluxos de laboratório, limites e intenção de busca desta ferramenta

Fluxo típico: rode padrões de BSA ou outra proteína, ajuste a região linear para obter inclinação e intercepto, corrija com branco a absorbância da amostra, informe esses três números, defina a diluição quando o alíquota medido foi diluído e registre a concentração ao lado do identificador da amostra. Frações de purificação de proteína, verificações de carga igual de lisados celulares, preparo de amostras ELISA e laboratórios didáticos precisam da mesma inversão determinística sem reabrir uma planilha.

Limites: esta ferramenta não substitui a necessidade de padrões, não corrige a resposta não linear do corante em alta carga de proteína, não converte entre equivalentes BSA e massa real do analito para cada espécie proteica, e não escolhe unidades—os resultados ficam nas unidades de concentração usadas pela curva padrão (comumente microgramas por mililitro ou miligramas por mililitro). Dilua amostras que leem acima do padrão mais alto até a faixa linear e passe o fator de diluição em vez de extrapolar às cegas.

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